2008年8月,荷兰科学家范德欧斯特(John van der Oost)通过生物化学方法鉴定了一系列Cas蛋白,并发现这些蛋白需要切割一段长为61碱基的前体RNA(crRNA)才能工作。他们证明了crRNA的作用,并通过人为设计相应的crRNA序列使菌株获得了抵抗噬菌体的特性。这是人类首次编辑CRISPR系统。
我们和夏彭蒂耶合作,用生物化学方法纯化了 Cas9 蛋白,发现它是双 RNA 引导的 DNA 内切酶,意思是这个蛋白能够和两条不同的 RNA 结合。一条是包含引导序列的 crRNA,能和DNA进行碱基配对。
在合作的过程中我们发现,另一条 tracrRNA 对于 crRNA 的加工处理很重要,对于寻找目标 DNA 的能力也是必要的,所以这是一个两条 RNA 的系统在和蛋白交互作用,形成进行监控的复合体。这个蛋白的运作方式是靠两把化学剪刀,在目标区域将 DNA 旋开后进行切割。重要的是,要切割的目标位置,必须是在 DNA 上的 PAM 模体旁边。
在了解运作的机制之后,我们意识到其实可以把系统进一步简化,弄得比自然界更为简单。我们将两条 RNA 合而为一,形成单链引导型态:一端包含需要搜寻的目标序列,另一段是和 Cas9 结合所需要的资讯。如此简化成双分子系统,一个蛋白被一条 RNA 引导至 DNA 序列,制造DNA 的双股断裂。